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Western Blot
来源:凯瑞力枫  发布时间: 2013-02-26 16:11

◆ Western Blot检测(含内参)

服务内容


1. 从动物细胞、人或动物组织、细菌、植物、血清等样品中提取蛋白
2. 对蛋白进行定性及半定量分析
3. Western blot检测
(1) 电泳:聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离蛋白样品
(2) 湿法转印(BLOTING:Tank Transfer)
(3) 杂交:用抗体鉴定膜上的特定蛋白(INCUBATION: Antibody)
(4) 化学发光检测(ECL),胶片曝光,ImageQuant TL软件读取IOD值(可选)
4. 预实验及正式实验服务:帮助客户设计样品上样顺序
5. 免费进行胞浆蛋白内参检测(胞核蛋白内参需收取费用)

样品要求(样品处理及保存见附件)

1. 细胞>1×107;组织>50mg;细菌湿重>50mg;植物>100mg;血清>50ul
2. 样品蛋白浓度>1mg/ml,蛋白量>200ug/样品
收费标准
具体膜的计算方法与客户交流实验设计后确定。



服务项目
收费标准¥
实验周期
预实验
蛋白抽提(总蛋白)
60/样品
1周
蛋白抽提(磷酸化蛋白)
100/样品
1周
蛋白定量
25/样品
1周
Western Blot检测(含胞浆蛋白内参)
1000/目的蛋白
2周
正式实验
蛋白抽提(总蛋白)
60/样品
1周
蛋白抽提(磷酸化蛋白)
100/样品
1周
蛋白定量
25/样品
1周
Western Blot检测(含胞浆蛋白内参)
2000/目的蛋白/膜
2周
正式实验
胞浆、胞核蛋白分开抽提
100/样品
1周
胞浆、胞核蛋白分开抽提(磷酸化蛋白)
150/样品
1周
蛋白定量
25/样品
1周
Western Blot检测(含胞浆、胞核、内参)
3000/目的蛋白/膜
2周
 
ImageQuant TL读取条带IOD值及计算
询 价!

客户提供材料
1、新鲜或正确保存的样品
2、目的蛋白一抗
3、阳性对照样品(尽量提供)
4、相关文献(可选)
提交给客户结果
1、预实验曝光结果(胶片及扫描图),预实验采取3个一抗稀释度
2、正式实验曝光结果(胶片及扫描图)
3、完整实验报告
4、IOD值分析报告(可选)

服务项目说明

1. 提供的蛋白量与目的待检测的蛋白数量有关,蛋白数量增加相应的样品量也要增加
2. 胞浆、胞核蛋白抽提样品来源为:哺乳动物细胞、动物组织。如果1个样品分别提取胞浆、胞核蛋白后,蛋白定量时以2个样品计算
3. 每张膜样品数量为1-8个,不足8个以8个收取。9-16个样品为2张膜,17-24个样品为3张膜;以此类推
举例:7个样品,1个目的蛋白,算1张膜;有9个样品,1个目的蛋白,算2张膜
7个样品,2个目的蛋白,算2张膜,有9个样品,2个目的蛋白,算4张膜
以上为一般算法。如果客户样品数量需要按照组别等来进行上样时需要重新确定每张膜的上样量及膜的张数
4. 选择部分样品进行预实验,参考目的蛋白一抗说明书进行3个稀释度的预实验
5. 向客户反馈预实验结果,等待客户确认预实验结果后确定是否进行正式实验
6. 请您提供质量保证的一抗(或委托我公司代购)。抗体的使用量通过预实验后进行确认,一般不回收使用一抗
7. 如果需要对膜上目的蛋白进行抗体剥离(洗脱或者 stripping)的,请提前说明(收费不同)
8. 建议提供目的蛋白阳性表达样品(纯蛋白、有阳性表达的细胞或组织、商品化的阳性对照产品等)作为阳性对照
9. 免费内参检测为:beta-actin,beta-tubulin,GAPDH,如果同时检测胞浆、胞核蛋白内参时胞核蛋白内参需要收取费用,参照“收费标准”
10. 如需进一步数据分析:ImageQuant TL软件读取IOD值、条带的Normalization处理、以及发表论文时所用条带的处理,请另询价
11. 对条带结果有特殊要求,请另询价
12. 双方签订合同后,收取50%首付后启动预实验
13. WB特殊要求请咨询

WB结果示例
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附:样品处理及保存(极为重要)

1、悬浮细胞样品:把细胞及培养液一起收集到15ml或者50ml离心管中,1500rpm离心3min,弃去上清;加入PBS轻轻吹打,1500rpm离心3min,弃去上清;反复3次,弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况一般保存1年,建议尽快检测。
2、贴壁细胞样品:
2.1 胰酶消化:用胰酶将细胞消化后,收集到15ml或者50ml离心管中,1500rpm离心3min,弃去上清;加入PBS轻轻吹打,1500rpm离心3min,弃去上清;反复3次,弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况一般保存1年,建议尽快检测。
2.2 细胞刮子收集细胞:对于某些蛋白(即对胰酶比较敏感或者实验特殊要求,如E-Cadherin不易用胰酶消化后进行WB检测),直接用细胞刮子刮下细胞,收集到EP、15ml或者50ml离心管中,1500rpm离心3min,弃去上清;加入PBS轻轻吹打,1500rpm离心3min,弃去上清;反复3次,弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况一般保存1年,建议尽快检测。
3、动物组织样品:取下合适的动物或者人的组织样品后用预冷的PBS或者生理盐水漂洗,尽量除尽残留血液,用滤纸把多余PBS吸取干净。把组织分成约50mg大小(依据实验目的需要进行调整),用锡纸分别包装好或者用冻存管装好,于-80度或者液氮中保存。在避免冻融的情况一般保存1年,建议尽快检测。
4、植物样品:取得待测植物样品后,用蒸馏水把泥土漂洗干净,用滤纸把多余水分吸取干净,分装成合适大小于-80度或者液氮中保存。在避免冻融的情况一般保存1年,建议尽快检测。
5、细菌样品:细菌培养完成后,10000rpm离心5min收集细菌,加入PBS吹打,10000rpm离心5min,弃去上清;反复3次,弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。
6、若要检测磷酸化蛋白,请在3个月内进行。长时间保存样品容易使磷酸化蛋白去磷酸化而检测不到磷酸化条带。
7、提取胞浆、胞核蛋白的样品应尽量采用新鲜样品,冻存样品提取的胞核蛋白可能会减少。
8、血液样品(血浆中蛋白):3000rpm离心20min后收集上清,分装后于-80度或者液氮冻存待用。3个月以内检测。
9、长距离运送样品时采用干冰或者液氮。
10、样品的实际需要量请打电话咨询。


抗体保存及使用
应严格按照抗体说明书进行保存,避免出现不必要的麻烦。在-20度保存呈液体状态的抗体请不要分装。新购抗体要在2-3月以内进行WB检测等实验,以验证抗体的有效性。一般新购抗体有非特异条带等问题出现,2-3个月内没有反馈给抗体公司,抗体公司将不再受理投诉。

ELISA

步骤 服务项目 时间 内容 收费
蛋白样品 动物模型建立  协商  根据客户要求建立各种动物(大鼠/小鼠等)模型  询价 
准    备 细胞系培养细胞模型建立  2周  根据客户要求培养相应的细胞,以及对培养的细胞进行分组,加入药物刺激处理等  询价 
蛋白提取  蛋白提取  1周 根据目的蛋白的定位及特性选择最佳抽取方法,要求组织>250mg,细胞数量>5×106 ¥65
总蛋白¥65/样品,核或者浆蛋白¥140/样品 ¥140
蛋白定量  蛋白定量  1周  选择正确的方法测定蛋白样品的浓度,常用的为BCA法,若需要特殊方法,提前说明  ¥25
ELISA 间接法ELISA 1周  间接法ELISA检测¥550/样品  ¥550
夹心法ELISA 1周  夹心法ELISA检测¥750/样品  ¥750
竞争法ELISA 2周  竞争法ELISA检测¥750/样品  ¥750

◆ 免疫沉淀及免疫共沉淀

服务内容

1. 非变性条件下提取细胞蛋白、变性、定量

2. 样品预处理:用Protein A/G Sepharose孵育

3. 样品与IP抗体进行孵育

4. Protein A/G Sepharose沉淀免疫复合物,并对免疫复合物进行洗涤

5. 沉淀产物WB鉴定(其它方法鉴定请提前说明)

 

收费标准

服务项目  收费标准¥  实验周期 
免疫沉淀  7500/基因  3-4周 
免疫共沉淀  8500/基因  3-4周 

终产品

检测结果及实验报告

服务说明

1. 待检测样品可以是待检测蛋白样品,也可以是细胞、组织等其他样品,但提取蛋白需另外收取费用;

2. 免疫沉淀用抗体;

3. 检测用抗体。
 

 

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