欢迎进入北京凯瑞力枫科贸有限公司!
当前位置:首页 > 公司新闻
联系我们
电话:+86-10-88118450
传真:+86-10-88136559
全国热线电话:4000-010-619
常见问题解答
来源:凯瑞力枫  发布时间: 2013-12-18 12:03

一、Southern杂交

 

问题1:电泳后发现凝胶中DNA扩散,导致结果难以确定,如何解决这一问题?

 

解决方案:(1)在操作上:电泳时隔孔上样,电泳后要对凝胶及时处理使凝胶干燥;(2)琼脂糖的质量应该较好,尤其是不应含有内切酶,否则有时将使低拷贝数基因的杂交结果难以解释。

 

问题2:传统方法中转膜不完全的问题如何克服?

 

解决方案:经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至24小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,因此,转膜不完全。向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形;加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度较快,转移效率高。   

 

利用地高辛标记探针进行 Southern 杂交时,对于大于15kb的 DNA片断,转膜之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的 DNA 被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。如果实验转膜过程中同时含有大于 15kbDNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物),那么在转移的过程中倾斜容器,仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸,这样既可以提高大片断 DNA 的转移效率,又不会打碎小片段DNA

 

另外,等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法,来解决这一难题:以转基因鼠的检测为例,实验步骤如下:1.转基因鼠的建立:以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF基因为构件,建立转基因小鼠。转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾DNASouthern进行鉴定。2.琼脂糖凝胶直接杂交 (1)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液,取少量电泳检查酶切完全后,上样电泳8小时,(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时,用镊子轻轻揭起凝胶,放于变性液(0.5MNaOH0.5MNaCl)20分钟,转置中和液(0.5MTrisHCl 0.15MNaCl)20分钟,将胶放于玻璃板上沥干液体,室温放置30分钟。(3)干胶应立即杂交。先将胶在水中泡一下,以利于操作。(4)将胶放人杂交液(6×SSC5×DenhardtS0.25% SDS100μg/ml鲑鱼精DNA),加人探针,42℃杂交16-20小时。(5)杂交完成后,洗膜8轮,42℃每次15分钟。2×SSC0.1%SDS1×SSC0.1SDS0.1×SSC0.1%SDS0.1×SSC0.1%SDS、各洗两次,在冰水中浸泡2分钟,以利于盐的排出。(6)干燥后按检测试剂盒操作,室温压片0.5-2小时。冲片照相。使用的探针为G-CSFDNA,探针标记采用Fluorescein-12-dUTP,检测试剂盒为杜邦公司产品,操作按试剂盒说明书进行。用琼脂糖凝胶直接杂交的方法,较好地解决了微量核酸或低拷贝数转基因的检测问题,结果不仅直观,而且特异性好。与常规的Southern杂交相比,它所具有的优势是,它省略了将DNA进行转膜的步骤,从而避免了因转膜不完全所造成的DNA量的损失,特别是低拷贝数基因的丢失。另一方面,也使复杂的Southern杂交操作程序大大简化。因此,在转基因鼠的鉴定中以及微量核酸检测、疾病诊断中是防止低拷贝数基因漏检的一种可行途径。

 

问题3:在向下转膜法中,如何提高转膜效率?

 

解决方案:1、转移液的水平面应略低于凝胶的水平面。如果转移液的水平面高于凝胶,短时间内会有大量液体聚集在凝胶上,直接从侧面流失;果转移液的水平面过分低于凝胶,影响纱布的吸水力,转移效率下降。2、吸水纸吸水后易变形,使吸水纸与滤纸间产生空隙,而降低吸水纸的吸水效率,应及时更换吸水纸。3、过夜转移时,及时添加转移液,防吸干。4、样本丰度高时,移时间可以缩短至1小时,此时凝胶上仍可见大分子量DNA的残留,当样本丰度低时,以延长转移时间。5、纱布上不要加盖重物,防凝胶受压变薄,响转移效率。

 

问题4:碱转移结束后的尼龙膜潮湿不利于保存,且防止长期保存过程中DNA结合不紧密影响杂交效果,应如何做?

 

解决方案:将尼龙膜置于滤纸上干燥片刻,在紫外交联仪中将转有DNA的一面向上12000J交联4 min,若尼龙膜暂不杂交,可在4℃下保存备用但存放时间不宜超过半年。

 

问题5:使用碱转移法,将导致杂交后探针的去除困难,几乎80%-90%的探针难以洗脱,如何解决这一问题?

 

解决方案:将煮沸的5g/LSDS溶液倒在膜上,待溶液自然冷却至室温,可除去膜上已杂交的DNA探针。洗脱后的尼龙膜,可反复用于其他探针的杂交(至少可耐5轮杂交与洗脱)

 

问题6Southern杂交中,探针的背景高,应如何解决?

 

解决方案:用随机引物法标记的探针要想得到最低的背景,在向尼龙膜上加prob-DIG Easy H yb混合物前,要用0.45μm醋酸纤维素膜过滤,勿用硝酸纤维素滤膜过滤。对每一个探针和目的片段,总是要根据经验确定最合适的杂交条件,探针浓度很关键,如果太高,将会非特异性结合到膜上;太低,敏感性会降低。   

 

利用地高辛标记探针进行 Southern 杂交时,以下 种措施可降低背景:(1)适当延长梯度洗膜的时间和提高洗膜温度;(2)控制地高辛抗体的浓度。使用足够量的地高辛抗体可以获得较好的杂交信号但过量的地高辛抗体会在膜上产生非特异结合斑点。

 

问题7Southern杂交没有检测出出杂交信号的原因,如何解决?

 

解决方案:(1)目的DNA在总DNA中所占的比例,一般需要 10μg DNA 样品如果样品中目的基因含量较高可以按比例减少DNA用量。如果基因组中目的基因的拷贝数较低致使常规的基因组用量不能满足Southern 杂交的需要此时可加大基因组的用量;(2)探针的浓度和比活性:在杂交袋中杂交需要0.2ml/cm2的杂交液;使用圆筒状瓶子进行杂交可以使用较小的体积,约 0.1ml/cm2。(3)转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对:(见问题23

 

二、Western blot中常见问题

 

问题1 在western实验中,通常有人采用TBS,有人采用PBS,在使用中有什么区别?
  

选择合适的缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS(因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围),TBSPH7.0以下缓冲能力较弱(不过PBS易污染)。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液,如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析,阳离子缓冲液首选TBS;阳离子交换层析时,阴离子缓冲液则首选PBSWestern blot中使用TBSPBS均可,只是要根据需要选择合适的浓度。
   

问题2没有注明可以用来做Western blot的一抗,可以用来做Western blot吗?   

 

不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的,识别构象型表位的抗体不能用于Western blotting,因为在Western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原,而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏
    

问题3Western每次只加一种一抗,可以同时加两种或者多种一抗的吗?
  

最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话,就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照,也是先上目的蛋白的一抗、二抗,ECL显色、压片、洗片;漂洗以后,再上内对照的一抗、二抗,ECL显色、压片、洗片。 
    

问题4Western blot 使用的膜哪种最好啊,PVDF好还是NC膜,如何选择?
  

PVDF膜价格较贵,可重复使用,特别适合蛋白印迹,结合能力较强,但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜,应用较广,结合牢固性差一些,韧性也不如PVDF,不能重复使用,但蛋白吸附容量高,亲水性较好。都可以用丽春红染色。具体使用还要参考相关文献
    

问题5为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多条带,而且好象都很有规律,为什么?是封闭时间不够吗?做Western必须要内参吗? 
  

一抗、或二抗抗体浓度太高,多克隆抗体本身的非特异性反应,抗体的特异性不强,目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀一致.这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化.所以严格意义上说,内参是必须做的。
    

问题6 Western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些?用于Western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求?
  

作为Western来讲,理论上单抗比多抗的特异性要好,但单抗种类较少一般价格偏高,可以去看看EarthOx他们家的,种类比较全,价格也比较合理。用于Western的抗体和用于ELISA的抗体,一般来说用于Western的抗体识别的是氨基酸序列特异性;而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类,有些是识别氨基酸序列特异性,有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。
  

做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题,一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白,另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带
    

问题7半干转是否要求膜,滤纸,胶同样大小?因为胶大小不一定规则,膜和滤纸会大一点,那样会不会短路?什么是短路?如何控制和发现短路呢?  

 

可以相等,但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了,上下两层虑纸也不能因过大而相互接触,这样同样会短路,电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行,正常的半干是慢慢变高的, 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。
    

问题8Western blot哪种染色好?
    

1) 阴离子染料是较常用的,特别是氨基黑,脱色快,背景低检测极限可达到1.5μg,考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度,但脱色慢,背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ,以便进行随后的氨基酸分析。缺点是:溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。
    

2) 胶体金,灵敏度高,检测范围可到pg级,但染色比稳定。
    

3) 生物素化灵敏度位于12之间,可用于任何一种膜。
    

问题9不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上, 转移效率低怎么样解决?
  

可以考虑:转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)(优化的转移缓冲液,可以参考《蛋白质技术手册》),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质和NC膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS,也是为了增加转移效率;用优质的转移膜,或使用小孔径的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交联;低浓度胶,如低至6%。太大时还可以考虑用琼脂糖胶;提高转移电压/电流;增加转移时间
   

问题10 DAB显色、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理是什么?
      

DAB显色在辣根过氧化酶的作用能形成一种灰褐色的终末产物,该产物难溶于醇和其他有机溶剂,DAB的氧化还能引起聚合作用,导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色中,酶将奈酚磷酸(底物)水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐(显色原)结合而产生有色的、不溶性偶氮染料
    

问题11酶显色与荧光显色之间,各自的优缺点是什么?  

 

免疫酶技术就是用酶(如辣根过氧化物酶)标记已知抗体(或抗原),然后与组织标本在一定条件下反应,如果组织中含有相应抗原(或抗体),抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时,能催化底物水解、氧化或还原,产生显色反应,这样就可以识别出标本抗原(抗体)分布的位置和性质,通过图像分析并可达到定量的目的
  

免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断,但是荧光抗体染色标本不能长期保存,对组织细胞的细微结构分辨不清,免疫酶技术则能克服上述不足,标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法,对石蜡切片标本尤为适用,为免疫病理研究开辟了一条新途径,酶显色产物具有较高的电子密度,经过适当处理还可以进行免疫电镜观察,免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术,前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上,形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应,称为非标记抗体酶技术


    问题12请问资料上所说的PVDF膜可以重复利用是什么意思?可以重复利用几次?
    

重复利用指的是可以在显影定影完成以后重新洗脱(stripping buffer)然后重新封闭,一抗(可以是不同的,前提是目的蛋白在pvdf膜上),二抗孵育,显影定影重复利用的情况还要看你的蛋白丰度 ,每一次stripping都会洗掉蛋白,同时有些抗体结合紧的也洗不完全,所以要看你的实验情况而定


    问题13结合ECL之后显影发现胶片上的条带是空心的,而且荧光很快就没了?


    一种情况是POD浓度高ECL很快被淬灭掉,导致蛋白丰度越高的地方反而没带,边缘地带反而有显色

 

问题14:要做磷酸化某因子Western blot,其二抗有何要求?

 

对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用HRP标记的二抗,EarthOx的质量过硬,价格公道且种类比较全,建议去他们网站查一下。

 

问题15Western blot结果中杂带较多

可能的原因及建议:

1目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等),本身可以呈现多条带。

查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小。

2一抗特异性不高

重新选择或制备高特异性的抗体,建议去国外品牌网站查一下,比如EarthOx的一抗

3一抗不纯

建议同上,或者自己纯化抗体

 

三、外源基因在大肠杆菌的表达

 

问题1:外源基因在大肠杆菌中高效表达易形成包含体,包含体形成有利于表达产物的纯化,但降低产生大量不具有生物活性的产物,如何降低包涵体的形成?

 

解决方案:(1)采用胰胨-磷酸盐培养基能够限制包含体的形成。(2)培养液中加入甜菜碱和山梨醇来改变渗透压,使表达产物由包含体形式转变为活性状态,将温度从37℃降低到25℃时诱导表达,可降低包含体的形成。(3)选用pMBI衍生而来的载体质粒,因为其可以协同表达DnaK-DnaJGroEL-GroES,增加凝结蛋白的溶解度。分子伴侣折叠作用效率与细胞DnaK-DnaJGroEL-GroES的浓度有关,与表达蛋白的性质有关。

 

问题2:在lactac 表达系统中IPTG 用于诱导lactac启动子的转录,但由于IPTG本身具有一定的毒性。从安全角度,对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG,应如何做?

 

解决方案:(1lac tac启动子的转录受温度严紧调控:把阻遏蛋白 LacI 的温度敏感突变体lacI(ts)lacIq(ts)插入表达载体或整合到染色体后,均能使 lac tac启动子的转录受到温度严紧调控在较低温度(30℃)时抑制,在较高温度(42℃)时开放。(2)用乳糖替代IPTG诱导lactac启动子的转录:乳糖在Β-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖,异乳糖具有诱导剂的作用这一过程涉及乳糖的转运和转化,其效率受到多种因素的影响和制约因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用,较多的乳糖存在也会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代 lPTG 作为诱导剂的研究要与发酵工艺结合起来,才能显示其良好的前景。

 

问题3T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的,但也不可避免出现在相对较高的本底转录,如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性,会影响细胞的生长。

 

解决方案:在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因:因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外,还能与T7 RNA聚合酶结合抑制其转录的活性。目前T7溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统,它能明显降低本底转录,但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。   

 

问题4:为了提高外源基因的表达水平,对表达载体如何进行改进?

 

解决方案:(l)可诱导拷贝数的表达载体。质粒的拷贝数由培养条件控制,当需要增菌培养时,质粒的拷贝数很低,每个细胞仅1-5个拷贝,经适当条件诱导后,载体拷贝数可达每个细胞100-500个拷贝。这种表达载体的优点减小了载体质粒的丢失,保证质粒在大肠杆菌中的稳定性,对外源基因的表达调控更为严格,有利于基因的高效表达。这里主要有两类条件控制拷贝数的表达载体,一类是基于质粒Rl基础上的单复制起始表达载体;另一类是双复制起始表达载体,一个复制起始来源于Co1EI,另一个来源于质粒pSC101(2)多顺反子型表达载体。这种表达载体的设计在于将第二个顺反子的SD序列插入在第一个顺反子的终止密码子TAA之前,第一个顺反子要尽量短,后面接目的基因的起始密码子ATG。由于第一个顺反子翻译地有效起始,使得大量的核糖体结合在多顺反子mRNA上,促进了核糖体对第二个顺反子的SD序列的识别和翻译起始,从而提高了表达水平。(3)带翻译增强子的表达载体。atpE基因SD序列上游的一段序列对其表达具有促进作用,它位于SD序列上游2-7bp处,这段序列在atpE基因的mRNA上核昔酸顺序为UUUUAACUGAAACAAA,将其插入到其它表达载体内构建的新型表达载体,对Β-干扰素和IL-2的表达提高了6-8倍。T7噬菌体基因10mRNA中有一个翻译增强子,它是一段与16sRNA的互补序列,提高了核糖体与翻译起始区的亲和力,将其插入SD序列上游或起始密码子下游均可提高翻译起始效率。

 

问题5:质粒的过度增殖以及其后目的基因的高效表达影响受体细胞的生长代谢,导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。如何解决?

 

解决方案:将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道:(1)采用条件控制拷贝数的表达载体,一类是基于质粒Rl基础上的单复制起始表达载体;另一类是双复制起始表达载体,一个复制起始来源于Co1EI,另一个来源于质粒pSC101;(2)将外源基因插入到大肠杆菌的染色体中chopin等报道,将分泌型IGF-I的基因,采用串连式的重复方式插入到大肠杆菌染色体的attλ位点,在不添加抗生素诱导的条件下,采用高密度发酵,IGF-I基因十分稳定。

 

问题6:在分泌型异源蛋白的表达中,附加的甲硫氨酸也可能改变蛋白质的免疫性质和药理性质,应如何去除?

 

解决方案:⑴ 在表达系统中共表达甲硫氨酸氨肽酶基因。 ⑵ 在分离纯化后在体外用外肽酶处理。但它们都对与甲硫氨酸相邻的氨莱酸残基类型有一定要求,因此在使用上有一定的限制。  

 

问题7:把所表达的目标蛋白外泌到细胞外的培养基中可以进一步减少蛋白水解酶的降解,也有利于分离纯化。如何实现目标蛋白的外分泌表达?

 

解决方案:(1)与大肠杆菌本身的外泌蛋白基因融合表达;(2)与一些能提高细胞外膜通透性的因子融合或共表达;(3)改变培养基的成分。但方法仅对外泌分子量较小的蛋白有效,而且外泌效率一般都比较低。

 

问题8:如何使外源基因高效表达?

 

解决方案:(1)表达质粒的优化和设计:构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码ATG 与 SD 序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻译效率有显著影响,具体表现为:SD序列 UAAGGAGG的翻译效率要比 AAGGA 3-6倍;翻译起始密码 ATG 与 UAAGGAGG的最适距离是6-8个碱基长度,与 AAGAA 的最适距离是5-7个碱基长度;ATG 与 UAAGGAGG 至少相隔 3-4个碱基,与 AAGAA 至少相隔个碱基mRNA 的翻译才能进行;ATGSD序列之间的碱基组成为A碱基丰富时,mRNA 翻译效率较高。其次,尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中 A/T 碱基的含量,降低mRNA 5’ 端形成的“茎环”结构的可能性,也是构建表达质粒时需要注意的事项。在必要的情况下,还可通过定点突变,PCR 等技术改变个别关键的碱基来破坏mRNA 5’端的“茎环”结构。把目标基因设计成多顺反子结构,在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因,一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因 5’端序列容易形成二级结构,而又不宜改变其序列的情形下。再者,在构建表达质粒时,充分利用各个基因的结构特征和特点,注意引入翻译增强子序列。(2)共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因:由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度有正比关系稀有密码子对应的tRNA的丰度很低,有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。可采用1.通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率高的同义密码子;2.在表达系统中共表达稀有密码子tRNA 基因,以提高大肠杆菌细胞内稀有密码子 tRNA 的丰度。(3)提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性:利用蛋白转运系统把目标蛋白最终累积在周质空间,或分泌到培养基中;采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌;对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表达;共表达能提高特定目标蛋白稳定性的辅助因子,如分子伴侣基因;对蛋白质序列中的蛋白水解酶敏感区域和识别位点进行改造;在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。(4)高密度发酵和工程化宿主细胞::大肠杆菌高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因的表达水平基本不变的前提下,通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。目前常用的发酵方式有:恒定培养、流加补料培养、连续培养三种。工程化宿主细胞:1.构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌是解决高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高,培养基中的溶氧饱和度往往比较低,氧气的不足导致菌体生长速率降低和乙酸的累积,乙酸的存在对目标基因的高效表达有明显的阻抑作用的根本途径。利用透明颤菌血红蛋白能提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率的生物学性质,把透明颤菌血红蛋白基因vgb 导入大肠杆菌细胞内以增加其对溶氧的宽容度。从而降低菌体产生乙酸所要求的溶氧饱和度阀值;用基因敲除技术缺失大肠杆菌的磷酸转乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因ackA,使从丙酮酸到乙酸的合成途径被阻断;改变代谢流的方向,通过共转化把枯草杆菌、酿酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS,单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因 pdc1 和乙醇脱氢酶基因 adh2 导入大肠杆菌,使丙酮酸的代谢有选择地向生成3-羟基丁酮或乙醇的方向进行。2.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌:rpoH基因编码大肠杆RNA聚合酶的r32亚基,r32 亚基对大肠杆菌中多种蛋白水解酶的活力有正调控作用。rpoH 基因缺陷的突变株己经被构建,研究结果表明它能明显提高目标基因的表达水平。

 

四、PCR反应

 

问题1:假阴性,不出现扩增条带

 

可能原因:

 

1)模板:①模板中含有杂蛋白质;②模板中含有Taq酶抑制剂;③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白;④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚,模板本身拷贝数低;⑤模板核酸变性不彻底。

 

对策:纯化模板;配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改;如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA

 

2)酶失活

 

对策:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

 

3)引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,

 

对策:①选定一个好的引物合成单位;②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度;③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效;④引物设计不合理,如引物长度不够引物之间形成二聚体等,需重新设计引物。

 

4Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

 

对策:调整Mg2+浓度,从1mM3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意:对实时定量PCR,使用3mM5mM的镁离子浓度。

 

5)反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul30ul50ul。或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要摸索条件,否则容易失败。

 

6)物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

 

对策:优化PCR温度,有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度。

 

7)靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。

 

问题2:假阳性:出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。

 

可能原因:

 

1)引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。

 

对策:需重新设计引物。

 

2)靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:

 

一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。

 

对策:①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。

 

二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生。

 

对策:可用巢式PCR方法来减轻或消除。

 

问题3:出现非特异性扩增带

 

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:

 

1)引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。(2Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。(3)酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

 

对策:①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。⑤降低Mg2+浓度。

 

问题4:出现片状拖带或涂抹带

 

可能原因:酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多。

 

对策:①减少酶量,或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量,减少循环次数。

 

五、 RT-PCR反应

 

问题1:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物

 

可能原因:

 

1RNA被降解

 

对策:①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA,使用良好的无污染技术分离RNA;②在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA;③如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT

 

2RNA中包含逆转录抑制剂

 

对策:通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25μg0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复。(逆转录抑制剂包括:SDSEDTA,甘油,焦磷酸钠,spermidine,甲酰胺和胍盐。)将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。

 

3)多糖同RNA共沉淀

 

对策:使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。

 

4)用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火

 

对策:①确定退火温度以适合引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。②对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体。③确定GSP是反义序列。

 

5)起始RNA量不够

 

对策:增加RNA量。对于<50ngRNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg0.5μg乙酰BSA

 

6RNA模板二级结构太多

 

对策:①将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火。②提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于>1kbRT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。不要在高于37℃时使用M-MLV。③如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。

 

7)引物或模板对残余的RNA模板敏感  对策:在PCR前用RNaseH处理。

 

8)靶序列在分析的组织中不表达  对策:尝试其他靶序列或组织

 

9PCR没有起作用

 

对策:对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。

 

问题2:污染造成假阳性

 

可能原因:

 

1)样品间的交叉污染

 

对策:①收集样品的容器最好使用一次性的,如重复使用,应在使用前应于180℃的高温下干烤6小时或更长时间;②样品存放时要密封严实,以防外溢造成相互间的交叉污染;③样品在提取过程中离心管及吸样枪头最好使用一次性的,以免不同实验样品间相互污染;④由于吸样枪污染会导致样品间的污染,也是一个值得注意的问题,由于操作不慎将样品或提取物吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源,因而加样或吸取时要十分小心,吸时要慢,吸取尽量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染;⑤同时要注意操作时不要剧烈地摇动反应管,开盖时也容易造成气溶胶污染。每次实验完毕都要及时清理实验台面,用0.5%次氯酸钠消毒后再打开紫外灯照射半小时。

 

2RT-PCR本身使用的试剂污染在试剂配制过程中,由于加样枪、容器及其它溶液被污染。

 

对策:所有试剂都应尽量小量分装,以减少重复加样次数,避免污染机会,另外RT-PCR试剂应尽可能密封好分类存放。每次操作完毕后同样要进行台面消毒和紫外线照射消毒。

 

3)扩增产物的污染,极微量的扩增产物污染就可造成假阳性。

 

对策;每次实验完后,扩增产物都要及时密封后处理。设阳性对照。

 

4)操作人员污染:只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解,从而影响结果的准确性,RNA酶可存在操作人员手汗、唾液中,也可灰尘中,一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染,容易造成实验失败。

 

对策;操作人员应戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。设置PCR操作专用实验室,所用实验用具应为专用,并合理分隔实验室,将样品的提取、配制RT-PCR反应液、PCR循环扩增等步骤分室进行,实验前应将实验室及实验人员工作服用紫外线或臭氧消毒以破坏残留的DNARNA

 

问题3:在无反转录酶的情况下,对照RNA获得扩增结果

 

可能原因;

 

1)对照RNA中含有痕量DNA

 

对策:第一链cDNA稀释1:101:1001:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。

 

2)有可能是引物二聚体的条带。

 

问题4:扩增产物滞留在加样孔中

 

可能原因:由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。

 

    对策:将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。另外,在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃,可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。

 

    问题5GAPDH内参抗体的选择

    在Western Bloting实验中,可能存在总蛋白浓度测定不准确,或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差;这些误差可以通过测定每个样品中实际转到膜上的内参,比如内参GAPDH的含量来进行校正。GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)是GAPDH抗体—GAPDH内参抗体大全参与糖酵解的一种关键酶,由430-40kDa的亚基组成,分子量146kDa,检测条带大约在36kDa。 GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达,广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。

    

    内参抗体虽然选择较多,但是也需要遵循一定的原则,并契合实际的应用要求。首先,我们需要考虑目的蛋白的大小,我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上,因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参,由于GAPDH的检测分子量大约在36kD,因此该内参抗体不是很适合用于检测30kD-40kD大小目标蛋白的WB实验中。另外,不同的组织来源的样本在选择内参时还有一定的区别。比如某些细胞中,由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高,不适合做内参。   

 

    我用过美国EarthOx公司的E021010 anti-GAPDH Mouse Monoclonal antibody,该抗体为单克隆抗体,其抗原为同时具有蛋白特异性和种属通用性的GAPDH蛋白部分序列,其检测种属非常的广泛,可识别人、小鼠、兔、大鼠、猴、狗、鸡、猪和绵羊的GAPDH蛋白,是一个真正保守的内参抗体。并且效价很高,能达到1:100010000的稀释倍数,性价比超高。

 

    问题6:如何选择β-actin内参抗体

 

    Actin即肌动蛋白,是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种,其中四种是不同肌肉组织特异性的,其余两种广泛分布于各种组织中,包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的,这是针对大多数组织和细胞来说的,它广泛分布于细胞浆内,表达量非常丰富,其含量占所有细胞总蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情况下,如脂肪组织或细胞β-Actin抗体推荐—高效价的内参抗体内,β-Actin的表达量就很少。β-actin375个氨基酸组成,分子量大小为42-43kDa左右。

    

    内参抗体虽然选择较多,但是也需要遵循一定的原则,并契合实际的应用要求。首先,我们需要考虑目的蛋白的大小,我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分 子量最好相差5KD以上,因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参,由于β-Actin的检测分子量大约在42kD,因此该内参抗体不是很适合 用于检测38kD-48kD大小目标蛋白的WB实验中。另外,虽然β-Actin是最合适的内参抗体之一,但是在某些条件下,一些因素也会导致样品间β-Actin含量的变化。特别需要注意的是,在脂肪组织里,β-Actin的表达量非常低,不适合作为内参。

 

    问题7:如何选择tubulin内参抗体

 

    Tubulin即微管蛋白,是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin,其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体,是形成微管的最主要的两种Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分别为55kDa50kDa,其实际检测条带均在55kDa左右。作为内参,β-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变,因此被广泛用于Western Blotting时上样量是否一致的参照,α-Tubulin和β-Tubulin构成微管蛋白的结构也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

 

    问题8:如何选择合适的β-Tubulin抗体?

 

    内参抗体虽然选择较多,但是也需要遵循一定的原则,并契合实际的应用要求。首先,我们需要考虑目的蛋白的大小,我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上,因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参,由于β-Tubulin的检测分子量大约在55kD,因此该内参抗体不是很适合用于检测50kD-60kD大小目标蛋白的WB实验中。另外,不同的组织来源的样本在选择内参时还有一定的区别。比如一些少量特殊的情况下,如脂肪组织或细胞内,β-Actin的表达量就很少,不适合做内参。

 

 

 

    问题9:线粒体内参抗体选择

 

    细胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase,简称COX)是一种异源寡聚酶,通常含有13个亚基,定位于线粒体内膜,是线粒体呼吸链的酶复合物。细胞色素c氧化酶中形成催化中心的3个最大的亚基由线粒体DNA编码,其余10个亚基包括COX IV由细胞核内的基因组DNA编码。细胞色素c氧化酶(COX)活性缺陷和人类多种疾病相关。COX IV抗体可用作线粒体蛋白上样量的内参抗体,其检测目标蛋白大小为16kD左右。

    

    常用的细胞总蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白β-Actin或β-Tubulin等。对于一些植物的样本,则需要特别的植物Actin蛋白作为内参。当实验样品中只是核蛋白,而不是细胞总蛋白提取液时,可以用组蛋白HHistone H),或者增殖细胞核抗原(PCNA)等为核内参抗体。而在一些特别的针对线粒体作为微环境的研究课题时,需要提取线粒体总蛋白并检测其中的目标蛋白含量,这时候常规的细胞总蛋白内参就不是很合适,我们推荐使用线粒体总蛋白的内参抗体,对于线粒体蛋白的检测,常用COX IVVDAC1作为内参抗体,这里面COX IV又是被引用最多的线粒体内参。COX IV的检测分子量大约在16kD左右,比较适合用于检测目标蛋白在较大的WB实验。

    

    如果您想买到一支性价比更高,质量有保障的COX IV抗体,我们向您推荐美国EarthOx公司的E021100 anti-COX IV Mouse Monoclonal antibody,效价高,建议浓度为1:1000,但在实际应用中,有科研人员能做到1:5000甚至更高。

 

    问题10HA标签抗体如何选择

    

    HA标签系统利用一个HA (流感病毒血凝素,influenza hemagglutinin epitope: YPYDVPDYA)短肽肽融合到目标蛋白。HA标签可位于蛋白质的C端或N端,该系统已广泛应用于多种细胞类型,相应的HA标签抗体也被广泛应用。HA 标签抗体能特异识别C末端或N末端带有HA标签(HA-tagged)的融合蛋白,也可以用于检测和HA tag融合表达蛋白的表达、细胞内定位,以及纯化、定性或定量检测HA tag融合表达蛋白等。

 

    问题11选择合适HA标签抗体需要考虑的因素

 

    我们在选择一个标签抗体时,主要根据自己实验应用上的需要。这里需要考虑的因素包括,HA抗体的应用检测类型、HA抗体的克隆性及制备来源等。比如该HA抗体是否能用于免疫荧光IF的检测?是否可以用于Western Bloting和免疫沉淀IP实验?是否需要HRP偶联的单克隆HA标签抗体?还是一个兔来源的HA多抗更合适?美国EarthOxHA标签抗体,单抗、多抗、HRP标记俱全,而且新推出几种不同克隆号混合型的Mix产品,方便客户的选择,能够满足不同实验室的要求。同时性价比也非常高,效价一般在1:5000左右,物美价廉的选择。

 

    问题12His标签抗体的选择

 

His标签是由6个组氨酸(His-His-His-His-His-His)组成的短肽,专门设计用于重组蛋白质的吸附纯化。由于分子量较小,并且较容易分离和纯化,His-tag 融合标签与其他标签相比有很多明显优势是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种。His抗体可以用于检测和His标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位,以及纯化、定性或定量检测His融合表达蛋白等。

 

选择His抗体时,其中需要考虑的因素包括了,His抗体的应用检测类型、His抗体的克隆性及制备来源等。比如该His抗体是否能用于Western Bloting的检测?是否可以用于免疫荧光IF实验?我是否需要特异性更好的单克隆His标签抗体?我是否需要考虑下是选择小鼠来源的还是兔来源的His抗体?

 

另外,应用类型越多,在使用过程中的选择余地就越大,而小鼠源的单克隆抗体一般在特异性、稳定性以及效价都要优于多克隆抗体。但具体情况也要根据实验情况来选择。

我们推荐美国EarthOx品牌的His标签抗体,有单抗、多抗等可供选择,效价高,质量稳定可靠,很多科研人员使用后都对该品牌抗体表示非常满意。

 

    问题13GFP标签抗体单抗和多抗的选择

    

    GFPGreen Fluorescent Protein,绿色萤光蛋白)是由下村脩等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质,在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色萤光。GFP标签可位于蛋白质的C端或N端,该系统已广泛 应用于各种细胞类型,包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等,相应的GFP标签抗体也被广泛应用。一般来说,GFP抗体不仅可以检测Abbkine GFP抗体—绿色荧光蛋白的单克隆和多克隆标签抗体GFP或其适当的突变体,也可以检测和GFP或其适当的突变体融合表达蛋白的表达、细胞内定位,以及纯化、定性或定量检测GFP融合表达蛋白等。

 

    问题14如何选择合适和最具性价比的GFP抗体?

 

    我们在选择一个标签抗体时,主要根据自己实验应用上的需要。这里需要考虑的因素包括,GFP抗体的应用检测类型、GFP抗体的克隆性及制备来源等。 比如该GFP抗体是否能用于免疫荧光IF的检测?是否可以用于Western Bloting和免疫沉淀IP实验?是否需要特异性更好的单克隆GFP标签抗体?一般来说,应用类型越多,在使用过程中的选择余地就越大,而小鼠源的单克隆抗体一般在特异性、稳定性以及效价都要优于多克隆抗体。另外,抗体的效价也是考察该抗体性价比的重要方面,也即相当于实际应用时的稀释比率。

    

    美国EarthOx公司提供多种GFP标签抗体供科研客户选择,不只有不同克隆号的单抗可供选择,还有不同克隆号的单抗混合型的Mix产品。多抗方面既有兔多抗也有小鼠多抗可供客户选择。一些客户还使用EarthOxGFP标签抗体发表了高影响因子的文章(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23696751)。

 

    问题15Myc标签抗体的选择

 

    Myc标签相当于人的c-Myc 410-419位肽段(序列为:EQKLISEEDL)。Myc标签可放在C端或N端,但Myc重组蛋白的低pH洗脱条件往往会降低蛋白质的活力,因此 Myc标签系统广泛应用于检测但很少用于纯化。Myc标签已成功应用于WB杂交技术、免疫沉淀IP和流式细胞术中。因此可用于检测重组蛋白在细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳细胞中的表达情况。我们在选择一个标签抗体时,主要根据自己实验应用上的需要。这里需要考虑的因素包括,Myc抗体的应用检测类型、Myc抗体的克隆性及制备来源等。比如 该Myc抗体是否能用于免疫荧光IF的检测?是否可以用于Western Bloting和免疫沉淀IP实验?是否需要特异性更好的单克隆Myc标签抗体?

 

    一般来说,应用类型越多,在使用过程中的选择余地就越大,而小鼠源的单克隆抗体一般在特异性、稳定性以及效价都要优于多克隆抗体,而多克隆抗体则具有亲和性更高的优势。另外,抗体的效价也是考察该抗体性价比的重要方面,也即相当于实际应用时的稀释比率。在选择抗体的时候,不但需要考虑抗体的量,还需要考虑抗体的效价,即不同应用的建议稀释比率。美国EarthOx公司的c-Myc标签抗体,效价高,科研客户给予相当高的评价

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23487454

 

    问题16:flag标签抗体的选择

 

Flag标签是一个与重组蛋白相融合的由 8个亲水氨基酸(DYKDDDDK)组成的多肽片断。Flag标签只有8个氨基酸组成,因此它不会占据其他表位与结合域,避免导致融合蛋白的功能、分泌性以及转运发生改变。由于它的亲水性特点,Flag标签倾向于定位在融合蛋白表面,因此更易与抗体结合以及被肠激酶酶解。

 

我们在选择Flag抗体时,主要根据自己的需要,特别是实验应用上的需要。另外,一个抗体检测后的应用类型越多,在使用过程中的选择余地就越大;而小鼠源的单克隆抗体一般在特异性、稳定性以及效价都要优于多克隆抗体。 另外,抗体的效价也是考察该抗体性价比的重要方面,也即相当于实际应用时的稀释比率。

 

美国EarthOx公司提供单抗、多抗、HRP直标flag抗体供客户选择,应用广,效价高,能够满足不同的实验要求,客户反馈结果很满意,并且已经有客户使用flag抗体发表了高水平的文章。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22790444

产品中心
实验试剂
实验耗材
仪器与设备
技术服务
技术文档
常见问题解答
流式细胞仪操作步骤
CD蛋白介绍
蓝白班筛选
诚聘英才
技术支持
渠道销售代表
销售内勤
试剂区域销售代表
Copyright © 2005-2017 北京凯瑞力枫科贸有限公司 京ICP备11011470号-1