欢迎进入北京凯瑞力枫科贸有限公司!
当前位置:首页 > 公司新闻
联系我们
电话:+86-10-88118450
传真:+86-10-88136559
全国热线电话:4000-010-619
碘克沙醇梯度提取哺乳动物原代细胞过氧化物酶体
来源:凯瑞力枫  发布时间: 2013-03-06 15:06

试剂和器材: 
1. OptiPrepTM(600g/L的碘克沙醇);
2. 匀浆介质:0.25mmol/L蔗糖溶液、1mmol/L乙二胺四乙酸、1g/L乙醇、5mmol/L 3-吗啉基丙磺酸(MOPS),pH7.2;
3. 稀释剂:6mmol/L乙二胺四乙酸、6g/L乙醇、30mmol/L MOPS,pH7.2;
4. 1mol/L 蔗糖溶液;
5. 按要求向匀浆介质和稀释剂中加入蛋白酶抑制剂;
6. 使用匀浆介质制备好的线粒体组分;
7. Dounce匀浆器(10ml宽松配制,Wheaton B型);
8. 两室梯度制备仪或Gradient MasterTM;
9. 5ml注射器(内径大约为0.8mm),带金属套管针;
10. 超速离心机,配有容纳30—40ml体积的固定角离心转子,最大转速大约为100000g,另带大约30ml容量的厚壁管;
11. 梯度收集器;

实验方法:
哺乳动物原代细胞培养。
原代细胞收集后,所有操作均在0—4℃进行。
1. 使用碘克沙醇、稀释剂、1mol/L蔗糖溶液和水分别根据不同的体积比配制一下梯度溶液:500g/L碘克沙醇(5+0.6+0.4+0.0)、400g/L碘克沙醇(4+0.6+0.7+0.7)和200g/L碘克沙醇(2+0.6+1.1+2.3);
2. 使用宽松配制的Dounce匀浆器在匀浆介质中对线粒体沉淀进行重悬(研杵研磨2—3次),相应地调整使得每克组织对应0.5ml体积;
3. 使用两室梯度制备仪或者Gradient MasterTM来制备线性梯度,使用注射器和金属套管针从200g/L和400g/L的碘克沙醇溶液中各取9ml,制备梯度溶液并置于适用于固定角离心转子的聚碳酸酯管中,每个梯度最底层均为2ml的500g/L碘克沙醇;
4. 在每个梯度溶液上层加入3ml混悬液,然后在105000g下离心1h;
5. 让转子从1000r/min开始持续减速,将梯度溶液收集于1ml中,密度越大的可越先得到收集。或者也可以用注射器和金属套管针来收集沿梯度溶液往下2/3距离上形成带的过氧化物酶体;



 

产品中心
实验试剂
实验耗材
仪器与设备
技术服务
技术文档
常见问题解答
流式细胞仪操作步骤
CD蛋白介绍
蓝白班筛选
诚聘英才
技术支持
渠道销售代表
销售内勤
试剂区域销售代表
Copyright © 2005-2017 北京凯瑞力枫科贸有限公司 京ICP备11011470号-1