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哺乳动物原代细胞培养的β-半乳糖苷酶(荧光测定)
来源:凯瑞力枫  发布时间: 2013-03-06 15:06

哺乳动物原代细胞培养的β-半乳糖苷酶(荧光测定)      

β半乳糖苷酶:β半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码,可催化半乳糖苷水解。

最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达,是最常用的监测转染率的报道基因之一。

以邻—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物可用标准的比色法检测酶活性,其检测动力学范围为6个数量级。氯酚红—β—D—半乳吡喃糖苷(CPRG)是另一个可用比色法检测酶活性的底物,其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG和荧光素二半乳糖苷(FDG)为底物则可用荧光法检测其活性。

此法可检测单个细胞的酶活性,并可用于流式细胞学(FACS)分析。如以二氧杂环丁烷为底物,可用化学发光法检测酶活性,其检测动力学范围最大,灵敏度最高,与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。

试剂和器材: 
1. 反应缓冲液:100mmol/L醋酸钠,100mmol/L KCl、2%(体积分数)Triton X-100、5mmol/L 二硫苏糖醇(DTT),pH4.3;
2. 底物:1.7mmol/L4-甲基-伞形酮-β-D-半乳糖苷(4-MUG)或邻—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG),溶于反应缓冲液中;
3. 微量离心机;
4. 荧光计:透射光波长355nm,激发光波长460nm,比色皿可容纳200μl样品;
5. 流式细胞学(FACS)分析
6. 37℃水浴锅;

实验方法:
哺乳动物原代细胞培养。
原代细胞收集后。
1. 用两倍体积的缓冲液进行稀释,然后于0—4℃下在微量离心机中离心10min以获得具有梯度的沉淀物;
2. 在0.25ml的反应缓冲液中重悬沉淀;
3. 与等体积的底物进行混匀,37℃孵育1h。使用0.25ml的反应缓冲液代替底物来作为样品空白;
4. 再配有一份底物空白;
5. 1h后测定荧光;
6. 流式细胞学(FACS)分析


 

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