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哺乳动物原代细胞培养的β-半乳糖苷酶(分光光度测定)
来源:凯瑞力枫  发布时间: 2013-03-06 15:06

试剂和器材: 
1.反应缓冲液:5g/L聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、0.05mol/L柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液,pH4.3;
2.终止液:0.25%甘氨酸-NaOH,pH10;
3.底物:6mmol/L对硝基苯基-β-半乳呋喃糖苷溶于缓冲溶液中;
4.微量离心机,带1.5—2.0ml小管;
5.分光光度计(可见波长)带1ml比色皿;

紫外-可见分光光度法测定酶活
酶活测定:以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
酶活定义:以ONPG为底物,37℃保温酶解,每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量,定义为1个酶活力单位。

实验方法:
1.每次检测,将0.5ml底物与沉淀于微量离心小管中的膜组分或50μl膜的混悬液混合;
2.如第1步设置空杯样,立即加入终止(缓冲液)1ml;
3.37℃孵育检测液30min;
4.加入1ml的终止(缓冲液)到检测液中;
5.在微量离心机中离心1—2min,去除任何沉淀物质;
6.读出在410nm波长下检测液相对于空白样的吸光值;


 

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