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原代细胞中期染色体的分离
来源:凯瑞力枫  发布时间: 2013-03-06 15:07

试剂和器材: 
1. 秋水仙胺;
 2. 2-甲-2,4-戊二醇缓冲液:1mol/L 2-甲-2,4-戊二醇、0.5 mmol/L CaCl2、0.1mmol/L Pipes-NaOH,pH6.8;
 3. 梯度溶液:用2-甲-2,4-戊二醇缓冲液配制成280 g/L、580 g/L和600g/L的Nycodenz○R;
4. 二甲基二氯硅烷(10g/L浓度溶于四氯化碳中);
5. 低速离心机与高速离心机;
6. 高速离心机,配吊桶式转子;
7. 用于吊桶式转子的15ml Corex管;
8. 23号注射器,带金属套管针;
9. 相差显微镜;
10. 双室梯度仪或者Gradient MasterTM;

实验方法:
1. 用二甲基二氯硅烷处理Corex管5min,然后60℃烘烤24h;
2. 向培养基中添加6×10-5g/ml的秋水仙胺,使培养原代细胞停滞在细胞分裂的中期,并孵育3h;
3. 轻轻振摇以选择性分离中期细胞,对分离的原代细胞4℃预冷20min,300g离心5min使之沉淀;
4. 用2-甲-2,4-戊二醇缓冲液重悬原代细胞并洗涤,之后再沉淀细胞(同步骤3);
5. 以相同的缓冲液重悬细胞(细胞浓度应小于2g/L),37℃孵育10min,用23号注射针抽吸细胞悬液数次以裂解细胞,通过相差显微镜观察监视裂解过程;
6. 2000g离心10min以沉淀染色体;
7. 在处理过的Corex管中用等体积的280g/L和580g/L Nycodenz○R制备10ml梯度溶液,并将用600g/L Nycodenz○R悬浮的染色体沉淀放置于管底;
8. 16300g离心10min,染色体带(密度约为1.23g/ml)大约处于梯度的2/3位置;
9. 原代细胞中期染色体可以通过显带法染色;


 

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