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免疫沉淀技术
来源:凯瑞力枫  发布时间: 2013-05-28 10:26

免疫沉淀技术

技术简介                                                

蛋白质作为生命形态中最重要的分子,一直以来都是全球科学家们研究的焦点。免疫沉淀技术是以抗体与抗原间的专一性为基础用于研究蛋白质相互作用的经典方法,也是确定两种蛋白质在细胞内相互性生理作用的有效方法。免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白A/GProteinA/G)或二抗偶联的agaoseSepharose珠子孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。随着对蛋白质研究的不断深入,人们将免疫沉淀方法与其他方法相结合,在其基础上衍生出很多更为复杂的技术,使蛋白质分析方法更为多样化,应用范围更为广泛。该技术现已广泛应用于基因、蛋白质以及其相互作用等研究领域。

技术分类                                                

随着对蛋白质研究的不断深入,人们将免疫沉淀方法与其他方法相结合,该技术现已广泛应用于基因、蛋白质以其相互作用等研究领域。按应用范围分类,可分为以下四类:

Ø  免疫沉淀(Individual protein immunoprecipitation, IP):利用抗体特异性从细胞裂解物或其他可溶性生物样品中纯化已知特定蛋白质。可用于测量蛋白质相对分子量,对已知抗原定量,确定蛋白质降解速率等目的。

Ø  免疫共沉淀(Protein complex immunoprecipitation , Co-IP):利用抗体沉淀相应特定抗原,同时沉淀与该抗原相互结合的其他分子,主要用于研究蛋白质相互作用,用于确定特定蛋白与感兴趣蛋白在天然状态下的结合情况。

Ø  染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP):在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断,通过免疫沉淀复合体特异性富集目的蛋白结合的DNA片段,再通过对DNA片段的纯化和检测,获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可用于研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达间的关系。将ChIP与基因芯片相结合形成的ChIP-on-chip方法,可用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;ChIP与体内足迹法相结合,可用于寻找反式因子的体内结合位点。

Ø  RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP):其原理与ChIP相近,但RNA免疫沉淀是用来研究与蛋白质结合的RNA在基因表达调控中的作用。

免疫沉淀的关键影响因素                                  

每种免疫沉淀方法都有一套固定的操作程序,但都是以抗原-抗体特异性结合为基础。目前常规操作是利用共价结合蛋白A或蛋白G的琼脂糖或磁性微球将反应后的抗原-抗体复合物富集纯化。蛋白A和蛋白G能特异地和抗体的保守区Fc段结合,形成稳定的抗原-抗体复合物附着在微球上,通过洗涤微球清除溶液内的杂质分子,再采用一系列方法分析纯化抗原或与抗原结合的其他分子。整个过程要考虑如下几个关键影响因素:

Ø  样品的处理

免疫沉淀实验的关键在于第一步样品处理。免疫沉淀实验本质是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应,而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中抗原的质量,如抗原的丰度及抗原的构象状态。样品处理应根据抗原样品的来源如组织样品、细胞或其他形式的样品,选择适当的方式进行细胞或组织破碎,使待检抗原释放至样品溶液中。裂解缓冲液的使用应注意添加合适的蛋白酶抑制,避免抗原或抗原-其他分子复合物被降解,另外,应选用去垢剂强度合适的裂解液,既保证有效抗原释放又不破坏蛋白质之间的相互作用。

Ø  抗体的选择

并不是所有抗体都能用于免疫沉淀,应选用经IP实验验证后的抗体以确保实验结果的可靠性。在考虑抗体特异性的同时,还需考虑抗体对抗原的亲和力,如单克隆抗体只对抗原的单一表位具有良好的特异性,因此在免疫沉淀中如果抗原表位暴露不充分,受到破坏,或受其他因素影响,造成抗体不能识别抗原,无法有效形成免疫沉淀复合物,将直接影响免疫沉淀的结果。多克隆抗体或混合单克隆抗体可以和抗原的多个表位结合,从而解决亲和力的问题。不同类型、同类不同亚型的抗体对蛋白 AG的亲和力不同,应选择合适的抗体及微球用于免疫沉淀。

Ø  微球的选择

目前广泛应用于免疫沉淀的微球以结合了蛋白 AG的琼脂糖和磁性微球为主。琼脂糖材料是无色透明、粒径达微米级的具有多孔表面的微球,有巨大的表面积,蛋白结合量高,在免疫沉淀操作中需要采用离心的方法达到固液分离,而反复离心产生的物理应力极易破坏蛋白的天然构象及完整性,且由于琼脂糖本身容易破碎,不易保存。相比之下,磁性微球其核心为超顺磁性粒子,核心外层包裹一层高分子材料,表面平滑,粒径可达纳米级,比表面积大,单位重量的微球蛋白结合量更大。超顺磁性微球可以在外加磁场中表现磁性,实现快速有效分离,大大缩短实验操作时间。温和的磁性分离方式避免反复离心对蛋白天然构象及完整性的破坏。超顺磁性微球在增大机械强度和稳定性的同时,缩减了产品造价。

Ø  在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

免疫沉淀实验操作过程 (磁珠法)                                 

Ø  抗原样品的制备:1)血清或细胞分泌上清液等:根据目标蛋白的丰度适当调整抗原原液浓度。2)细胞裂解上清液:样品是悬浮细胞,离心收集后用PBS洗涤2次,按比例加入细胞裂解液冰上裂解一定时间,离心收集上清液;样品是贴壁细胞,移去培养基后用PBS洗涤2次,把细胞刮脱收集至EP管,按比例加入细胞裂解液冰上裂解细胞一定时间,离心收集上清液。3)细菌裂解上清液:每克菌体按比例加入裂解缓冲液重悬,简短超声裂解细胞,离心收集上清液。如样品来源于组织或其他形式样品,也应选择合适的裂解缓冲液及方式进行破碎,使待检抗原释放至样品溶液中。

Ø  磁性微球与抗体结合反应:1)磁珠的准备及预平衡:取一定量磁珠悬液至EP管内,把EP管置于磁性分离器上分离固液,用平衡缓冲液洗涤2遍;2)抗体与磁珠反应:用平衡缓冲液将所需抗体稀释至一定体积,与预平衡后的磁珠混合反应一定时间,反应结束后通过磁性分离移走上清液;3)磁珠-抗体复合物的洗涤:从磁性分离器上取下EP管,加入平衡缓冲液用微量移液器轻吹抗体-磁珠复合物使其均匀分散,再经磁性分离移走上清,重复操作1次,去除残留未结合抗体和其他杂质等。

Ø  抗原沉淀反应:1)抗原与抗体反应:向抗体-磁珠复合物中加入一定体积的抗原溶液,用移液器轻吹使磁珠分散均匀,孵育时间及温度根据抗体与抗原结合强弱适当调整,反应结束后通过磁性分离移走上清;2)磁珠-抗体-抗原复合物的洗涤:加入一定体积洗涤缓冲液轻吹磁珠使其分散,通过磁性分离移走上清,重复操作2次,是去除非特异性粘附的蛋白及杂质。3)加入一定体积洗涤缓冲液轻吹磁珠,用移液器将悬液转移至新的EP管中,以为避免原管壁上非特异性吸附的蛋白被一起洗脱,影响免疫沉淀结果。

Ø  抗原/抗原-其他分子复合物的洗脱及鉴定:1)变性洗脱:磁珠-抗体-抗原复合物与一定体积SDS Loading Buffer混合加热,通过磁性分离收集的上清液可直接用于SDS-PAGE检测;2)非变性洗脱(复合物保持完整可用于后期功能分析):磁珠-抗体-抗原复合物与一定体积洗脱缓冲液混合反应一定时间,通过磁性分离收集上清液,如果洗脱缓冲液的pH较低,收集上清液后立即用碱性缓冲液调节pH至中性。

免疫共沉淀实验操作过程举例                                

Ø  RIPA提取样品蛋白,取少量裂解液以备Western blotingt分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育;

Ø  准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠;

Ø  将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%);

Ø  免疫沉淀反应后,在4°C 3000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗34次;最后加入SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

Ø  SDS-PAGEWestern blotting或质谱仪分析。

 

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