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ELISPOT & 藻酸盐包裹实验
来源:凯瑞力枫  发布时间: 2014-12-08 09:16

 


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ELISPOT

1. PBS 溶解抗原为30 μg/ml,加100 μl/孔于PVDF 膜铺底的96 孔灭菌板过夜;
2. 第二天吸去包被液后,加5%FCS 的PRMI 1640 培养基100 μl 封闭1 小时,
 37 oC;
3. 准备脾细胞悬液(用氯化铵去除红细胞,制备成单个脾淋巴细胞悬液);
4. 从1 × 106/孔开始,按1:3 的稀释度开始逐孔稀释做不同浓度梯度,并做3 个
复孔,37 oC 静置培养5 小时;
5. PBS 洗3~5 次,生物素化的抗鼠IgG 二抗孵育30 min;
6. PBS 洗3~5 次,链亲和素标记的碱性磷酸酶孵育30 min;
7. PBS 洗3~5 次,用底物BCIP/NBT 显色,显微镜下观察显色反应,显色后及
时终止反应;
8. 计数每孔中的斑点数目,计算每106 个脾细胞中抗体分泌细胞数量。

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藻酸盐包裹实验

1. 将藻酸钠溶于无菌生理盐水,终浓度为1.5%;
2. 收集培养的肿瘤细胞,用无血清的培养基洗涤1 次,将细胞沉淀重悬于1.5%
藻酸钠溶液中;
3. 将上述肿瘤细胞悬浮液用1 ml 加样枪缓慢滴入磁力搅拌的250 mM CaCl2
液中,形成乳白色的藻酸盐小珠。继续静置于250 mM CaCl2 中30 min 即可
使用。以上操作步骤均在无菌条件下进行;
4. 将第4 次免疫后7 天的小鼠用苯巴比妥钠0.1ml (按100 mg/kg 计) 腹腔注射
麻醉,小鼠麻醉后置于解剖台上,切开背部皮肤,皮下植入4 粒藻酸盐包裹
颗粒,缝合皮肤,外敷手术胶膜;
5. 天以后,小鼠经尾静脉注入100 μl (按100 mg/kg 计) FITC 标记的葡聚糖
(FITC-Dextran);
6. 20 min 后处死动物,取出藻酸盐颗粒,常温下加入1 ml 的生理盐水,剪碎研
磨颗粒,再加入1 ml 的生理盐水,混匀标本,放置1 小时,1500 rpm 离心5 min。
取上清液用荧光酶标仪测定;
 
7. 用不同浓度的FITC-Dextran 制备标准曲线。

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