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ELISPOT
1. PBS 溶解抗原为30 μg/ml，加100 μl/孔于PVDF 膜铺底的96 孔灭菌板过夜；
2. 第二天吸去包被液后，加5％FCS 的PRMI 1640 培养基100 μl 封闭1 小时，
37 oC；
3. 准备脾细胞悬液（用氯化铵去除红细胞，制备成单个脾淋巴细胞悬液）；
4. 从1 × 106/孔开始，按1:3 的稀释度开始逐孔稀释做不同浓度梯度，并做3 个
复孔，37 oC 静置培养5 小时；
5. PBS 洗3～5 次，生物素化的抗鼠IgG 二抗孵育30 min；
6. PBS 洗3～5 次，链亲和素标记的碱性磷酸酶孵育30 min；
7. PBS 洗3～5 次，用底物BCIP/NBT 显色，显微镜下观察显色反应，显色后及
时终止反应；
8. 计数每孔中的斑点数目，计算每106 个脾细胞中抗体分泌细胞数量。
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藻酸盐包裹实验
1. 将藻酸钠溶于无菌生理盐水，终浓度为1.5%；
2. 收集培养的肿瘤细胞，用无血清的培养基洗涤1 次，将细胞沉淀重悬于1.5%
藻酸钠溶液中；
3. 将上述肿瘤细胞悬浮液用1 ml 加样枪缓慢滴入磁力搅拌的250 mM CaCl2 溶
液中，形成乳白色的藻酸盐小珠。继续静置于250 mM CaCl2 中30 min 即可
使用。以上操作步骤均在无菌条件下进行；
4. 将第4 次免疫后7 天的小鼠用苯巴比妥钠0.1ml (按100 mg/kg 计) 腹腔注射
麻醉，小鼠麻醉后置于解剖台上，切开背部皮肤，皮下植入4 粒藻酸盐包裹
颗粒，缝合皮肤，外敷手术胶膜；
5. 天以后，小鼠经尾静脉注入100 μl (按100 mg/kg 计) FITC 标记的葡聚糖
(FITC-Dextran)；
6. 20 min 后处死动物，取出藻酸盐颗粒，常温下加入1 ml 的生理盐水，剪碎研
磨颗粒，再加入1 ml 的生理盐水,混匀标本，放置1 小时，1500 rpm 离心5 min。
取上清液用荧光酶标仪测定；
7. 用不同浓度的FITC-Dextran 制备标准曲线。
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